聚丙烯酰胺凝膠電泳色譜儀（簡稱聚丙烯酰胺凝膠電泳儀）的支持介質有原性凝膠和變性凝膠。原性凝膠是在凝膠中不加變性劑，蛋白質在這種凝膠中的遷移率受它們的靜電荷和分子大小兩個因素的影響，分子量不同，而帶靜電荷相同，可能遷移率相同。因此，在原性凝膠中進行電泳不能測定蛋白質分子量。變性凝膠是在凝膠中加入變性劑如尿素、十二烷基磺酸鈉（SDS）、巰基乙醇和二硫蘇糖醇等，可破壞或改變蛋白質的結構，把絕大部分蛋白質解離成亞基。同時，在蛋白質分子周圍包圍了大量負電荷，掩蓋了無變性劑存在時就有的任何電荷。蛋白質在變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對數成直線關系，利用變性凝膠進行電泳可測定蛋白質分子量。目前應用較多的變性劑是SDS。

一、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，能破壞蛋白質分子間的結構，尤其是在強還原劑如巰基乙醇存在下使蛋白質分子內的二硫鍵還原打開，并以其疏水基與蛋白質分子的疏水區相結合，形成牢固的帶負電荷的蛋白質－SDS復合物。在一定條件下，SDS與大多數蛋白質的質量結合比為1.4：1，所引入的凈電荷大約為蛋白質本身凈電荷的10倍，使其所帶電荷遠超過蛋白質原有的凈電荷，從而清除或大大降低了不同蛋白質之間所帶凈電荷不同對遷移率的影響。

SDS與蛋白質結合后還引起了蛋白質構象的改變。由蛋白質－SDS復合物的流體力學和光學性質表明，它們在水溶液中的形狀近似于雪茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸與蛋白質的分子量成正比，消除了電泳過程中蛋白質分子形狀對遷移率的影響。

因此，蛋白質－SDS復合物在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）中的遷移率不再受蛋白質原有電荷和形狀等因素的影響，而主要取決于蛋白質分子量大小。

蛋白質分子的電泳遷移率與分子量的計算公式為：

lgM = a－bR_f

式中：a為丙烯酰胺單體的質量，b為交聯劑的質量，R_f = 蛋白質染色后的遷移距離/溴酚藍在染色后遷移距離。

測定時，通常選用已知分子量的標準蛋白質作為標記物，與分子量未知的待測蛋白質樣品在同一條件下進行SDS－PAGE電泳，將已知分子量的標準蛋白質的相對遷移率作橫坐標，相應分子量的對數作縱坐標，繪制標準曲線，根據待測蛋白質樣品的相對遷移率可在標準曲線上求得分子量。

現在經SDS－PAGE電泳測定過的蛋白質已有一百多種，具有分辨率高、重復性好、設備簡單、操作簡便和快速等特點，已發展成為蛋白質研究的有力工具。在分子量為15000～20000范圍內，與用其它方法相比，誤差一般在±10%以內。

二、用SDS－PAGE電泳測定蛋白質分子量時應注意的問題：

1、如果蛋白質－SDS復合物不能達到1.4gSDS：1g蛋白質的比率，并具有相同的構象，不能得到準確的結果。

影響蛋白質與SDS結合的主要因素有：

（1）二硫鍵是否完全被還原：

只有在蛋白質分子內的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結合到蛋白質分子上，并具有相同的構象，一般以巰基乙醇作還原劑。有些情況下，還需進一步將形成的巰基烷基化，以免在電泳過程中重新氧化而形成蛋白質聚合體。

（2）溶液中SDS的濃度：

溶液中SDS的總量至少比蛋白質的量高3倍，一般高10倍以上。

（3）溶液的離子強度：

溶液的離子強度應較低，最高不能超過0.26。因為SDS在水溶液中是以單體和分子團的混合體存在，SDS結合到蛋白質分子上的量僅決定于平衡時SDS單體的濃度而不是總濃度，在低離子強度的溶液中，SDS單體具有較高的平衡濃度。

2、不同的凝膠濃度適用于不同的分子范圍：

在濃度為5%、交聯度為2.6%的凝膠中，分子量為25000～200000的蛋白質分子量的對數與遷移率成直線關系。

在濃度為10%、交聯度為2.6%的凝膠中，分子量為10000～70000的蛋白質分子量的對數與遷移率成直線關系。

在濃度為15%、交聯度為2.6%的凝膠中，分子量為10000～50000的蛋白質分子量的對數與遷移率成直線關系。

濃度為3.33%、交聯度為2.6%的凝膠可用于分子量更高的蛋白質。

可根據所測分子量范圍選擇最合適的凝膠濃度，并盡量選擇分子量范圍和與待測樣品相近的蛋白質作標準蛋白質。標準蛋白質的相對遷移率最好在0.2～0.8之間均勻分布。

影響SDS－PAGE電泳遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次將各項條件都控制得完全一致。因此，用SDS－PAGE電泳測定分子量時，每次測定樣品必須作標準曲線。

3、有許多蛋白質由亞基或兩條以上肽鏈組成，它們在SDS和巰基乙醇的作用下解離成亞基或單條肽鏈。對于這類蛋白質，SDS－PAGE電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的數據，必須用其它方法測定其分子量和分子中肽鏈的數目等，與SDS－PAGE電泳的結果相互參照。

4、不是所有蛋白質都能用SDS－PAGE電泳測定其分子量，已發現有些蛋白質用這種方法測定的分子量不可靠。這些蛋白質有電荷異常和構象異常的蛋白質、帶有較大輔基的蛋白質（如某些糖蛋白）、一些結構蛋白質（如膠原蛋白）等，因為盡管結合了正常比例的SDS，但仍不能完全掩蓋其原有電荷的影響。對于這些蛋白質，至少要用兩種方法來測定分子量，相互驗證。

   

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